Aktywność star
Aktywność star – własność enzymów restrykcyjnych polegająca na obniżeniu lub zaniku specyficzności ich działania, objawiająca się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne[1]. Wraz ze spadkiem specyficzności, cięciu podlegają miejsca coraz bardziej różne od oryginalnej sekwencji restrykcyjnej. Nazwa zjawiska pochodzi od oznaczenia alternatywnej aktywności, w odróżnieniu od zwykłej, znakiem * (EcoRI* zamiast EcoRI)[1][2][3]. Obecnie produkowane są rekombinowane enzymy ze zmniejszoną lub zniesioną aktywnością star.
Najczęstszy zanik specyficzności polega na cięciu sekwencji różniących się od restrykcyjnej jednym nukleotydem, cięciu sekwencji krótszych o nukleotydy początkowe[4].
Na pojawienie się aktywności star w reakcjach z udziałem enzymów restrykcyjnych ma wpływ wiele czynników (choć każdy z różną siłą i to zależnie od enzymu, np. EcoRI jest bardziej wrażliwy na podwyższone stężenie glicerolu niż na podwyższone pH[5]), między innymi:
- wysokie stężenie glicerolu (powszechny składnik buforów do przechowywania enzymów);
- nadmiar enzymu do ilości DNA;
- niska siła jonowa (<25mM)[2];
- wysokie pH (>8,0)[2];
- obecność odczynników organicznych (DMSO, etanol, glikol i inne)[6];
- zastąpienie jonów Mg2+ innymi jonami metali dwuwartościowych: Mn2+, Cu2+, Co2+, Zn2+.
Aktywność star jest zwykle zjawiskiem niepożądanym, utrudniającym i wprowadzającym zmienność do przeprowadzanego eksperymentu. Problem ten staje się wyraźny w przypadku reakcji z użyciem kilku enzymów restrykcyjnych naraz (cięcie wielokrotne), gdy trudne jest zapewnienie warunków optymalnych każdemu z nich.
Aktywność star można redukować stosując się do zaleceń producenta enzymów, takich jak:
- używania enzymu w minimalnej ilości potrzebnej do pocięcia danej ilości DNA (zmniejsza ilość glicerolu w próbce oraz zapewnia odpowiedni stosunek enzymu do DNA, wydłuża jednak czas reakcji);
- pozbycie się śladów odczynników organicznych (szczególnie etanolu używanego powszechnie do izolacji DNA);
- zapewnienie odpowiednio wysokiej lub specjalne zawyżanie siły jonowej (niektóre enzymy są jednak inhibowane przez wysoką siłę jonową);
- utrzymywanie pH reakcji w okolicach 7,0 (wyższe pH reakcji bywa efektem używania niewystarczająco czystego DNA izolowanego metodą lizy alkalicznej);
- używanie Mg2+ jako jonów dwuwartościowych wspomagających pracę enzymu i unikanie zanieczyszczeń innymi jonami.
Przypisy edytuj
- ↑ a b M Nasri , D Thomas , Relaxation of recognition sequence of specific endonuclease HindIII, „Nucleic Acids Research”, 14 (2), 1986, s. 811–821, DOI: 10.1093/nar/14.2.811, PMID: 3003698, PMCID: PMC339466 .
- ↑ a b c B Polisky i inni, Specificity of substrate recognition by the EcoRI restriction endonuclease, „Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America”, 72 (9), 1975, s. 3310–3314, PMID: 242001, PMCID: PMC432981 .
- ↑ R.C. Gardner i inni, Cloning and sequencing of restriction fragments generated by Eco RI*, „DNA”, 1 (2), 1982, s. 109–115, DOI: 10.1089/dna.1.1982.1.109, PMID: 6299666 .
- ↑ F. Barany , The TaqI ‘star’ reaction: strand preferences reveal hydrogen-bond donor and acceptor sites in canonical sequence recognition, „Gene”, 65 (2), 1988, s. 149–165, DOI: 10.1016/0378-1119(88)90452-0, PMID: 2842230 .
- ↑ J. George , R.W. Blakesley , J.G. Chirikjian , Sequence-specific endonuclease Bam HI. Effect of hydrophobic reagents on sequence recognition and catalysis, „Journal of Biological Chemistry”, 255 (14), 1980, s. 6521–6524, ISSN 0021-9258, PMID: 6248525 .
- ↑ Ernst Malyguine , Patrick Vannier , Pierre Yot , Alteration of the specificity of restriction endonucle, ases in the presence of organic solvents, „Gene”, 8 (2), 1980, s. 163–177, DOI: 10.1016/0378-1119(80)90035-9, PMID: 6244210 .
Bibliografia edytuj
- Star Activity (relaxed or altered specifity). New England Biolabs, Inc.. [dostęp 2018-08-11]. (ang.).