Optymalizacja reakcji PCR
Optymalizacja reakcji PCR – reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest jednym z najczęściej wykorzystywanych narzędzi w biologii molekularnej, która umożliwia amplifikację materiału genetycznego. PCR jest niezwykle czułą metodą, przy której należy uważać aby materiał nie został zanieczyszczony. W celu osiągnięcia dokładniejszych wyników, poprawy wydajności i uniknięcia błędów laboratoryjnych wykonuje się optymalizację. Optymalizacja polega na dobraniu najbardziej optymalnych warunków dostosowanych do potrzeb doświadczenia.
- STARTERY
Startery muszą być odpowiednio zaprojektowane w taki sposób, aby nie tworzyły dimerów i struktur drugorzędowych. Projektując startery należy pamiętać, że optymalne startery zawierają 40–60% zasad G+C. Odpowiednie stężenie wybiera się, przeprowadzając wiele reakcji i porównując wyniki[1], najczęściej jednak stosuje się 50 pikomoli na 50 mikrolitrów reakcji.
- JONY MG2+
Ustalenie stężenia jonów magnezowych, wchodzących w skład kompleksu wraz z dNTPami, starterami i matrycowym DNA jest bardzo ważne, ponieważ magnez jest kofaktorem polimerazy Taq, a określenie optymalnego stężenia jest kluczowe dla powodzenia rekcji[2]. Zbyt wysokie stężenie jonów skutkuje wytworzeniem produktów niespecyficznych i może prowadzić do wzmożonych pomyłek polimerazy. Zbyt niskie stężenie powoduje obniżenie wydajności reakcji. Optymalne stężenie wyznacza się doświadczalnie przeprowadzając szereg prób o różnych stężeniach[3].
- Deoksynukleotydy dNTP
Deoksynukleotydy muszą być zastosowane w odpowiedniej proporcji, ponieważ jej zaburzenie może spowodować błędy podczas wbudowywania ich do nowo utworzonej nici[4]. DNTPy mają właściwość wiązania jonów magnezu i obniżanie ich stężenia w roztworze. Zbyt wysokie stężenie może doprowadzić do zahamowania reakcji[2].
Przypisy edytuj
- ↑ KIERAT S., K. LEŚ, M. PRZYBYLSKI, T. DZIECIĄTKOWSKI, G. MŁYNARCZYK, 2012. Opracowanie metody PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania wirusa ospy wietrznej i półpaśca z wykorzystaniem fluorescencyjnej sondy typu TaqMan. MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2012, 64: 139 – 149.
- ↑ a b P. Markoulatos, N. Siafakas, M. Moncany, Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach, „J. Clin. Lab. Anal.”, 16 (1), 2002, s. 47–51, DOI: 10.1002/jcla.2058, PMID: 11835531.
- ↑ MARKOWSKA-DANIEL I., A. JABŁOŃSKI, A. NOWAK, K. STĘPNIEWSKA, Z. PEJSAK, 2009. Opracowanie testu PCR do wykrywania genu kodującego dermonekrotoksynę Pasteurella multocida w wymazach z nosa świń. Medycyna Wet. 2009, 65 (8).
- ↑ Bernard A. Kunz, Susanne E. Kohalmi, Modulation of mutagenesis by deoxyribonucleotide levels, „Annu. Rev. Genet.”, 25, 1991, s. 339–59, DOI: 10.1146/annurev.ge.25.120191.002011, PMID: 1812810.