Rekonstytucja białek w błonę lipidową

Rekonstytucja białek w błonę – jest to proces działań polegających na wbudowaniu białek (najczęściej białek membranowych, kanałów jonowych) w błonę biomimetyczną (sztucznie utworzona błona lipidowa, formułą i składem przypominająca błonę biologiczną komórki). Głównym celem stworzenia sztucznych membran biomimetycznych, których zadaniem jest naśladowanie błon biologicznych, a także rekonstytucja białka membranowego jest poznanie oraz zrozumienie wielu mechanizmów mających miejsce w żywych komórkach. Istnieje wiele metod pozwalających na wbudowanie oraz na zbadanie powodzenia przeprowadzonego procesu. Kanały jonowe kontrolują to, co wchodzi i wychodzi z komórki, a receptory są odpowiedzialne za komunikację między różnymi komórkami. Białka błonowe mogą również pełnić ważne funkcje enzymatyczne lub strukturalne. Ze względu na te kluczowe role dysfunkcja wielu białek błonowych wiąże się z szerokim zakresem chorób u ludzi i stanowią potencjalne cele terapeutyczne dla wielu schorzeń.

Rekonstytucja białka

Białka błonowe mogą zostać wprowadzone do błony w formie ,,bezpośredniej”, za pomocą proteoliposomów bądź z wykorzystaniem nanodysków polimerowych. Pierwszy sposób wprowadzania białek, w postaci surowej jest bardzo rzadko wykorzystywany, ponieważ zanurzenie ich w rozpuszczalniku organicznym (w obecności którego tworzona jest membrana), może doprowadzić do denaturacji białka. Rekonstytucja kanałów jonowych za pomocą proteoliposomów polega na umieszczeniu badanego białka na ścianie liposomu, a następnie fuzji tego liposomu z dwuwarstwą. Fuzja takiego kompleksu może zostać wywołana za pomocą gradientu stężeń czy obecności jonów wapniowych w roztworze. W przypadku nanodysków polimerowych stosowane jest kapsułkowanie czyli zamykanie białka błonowego wraz z lipidami w nanodysku polimerowym.

Aktywność białka

Jedną z metod badania aktywności wbudowanego białka w błonę jest wykorzystanie BLM (black lipid membranes) czyli czarnej błony lipidowej. Zostaje ona stworzona na niewielkim otworze, znajdującym się na hydrofobowym materiale np. teflonie. Średnica takiego otworu najczęściej wynosi od kilku do kilkuset mikrometrów. Aby możliwe było powstanie czarnej błony, konieczne jest wstępne nałożenie roztworu lipidów na otwór, ruchem przypominającym malowanie, a następnie umieszczenie naczynia w wodnym roztworze soli np. KCl. Lipidy najczęściej rozpuszczane są w hydrofobowych rozpuszczalnikach takich jak n- dekan, ponieważ wykazują one wysoką lepkość. Po umieszczeniu naczynia w wodnym roztworze soli, na otwór ponownie nakładana jest bardzo niewielka ilość roztworu lipidów. Monowarstwa lipidowa tworzy się w sposób spontaniczny na granicy faz organicznej i wodnej po obu stronach otworu. W związku z tym, że ścianki naczynka są hydrofobowe, roztwór lipidów wypiera roztwór wodny z otworu i obie monowarstwy łącza się, tworząc dwuwarstwę lipidową. Jednak dookoła otworu pozostaje znaczący pierścień rozpuszczalnika tzw. obrzeże Plateau-Gibbsa, który pozwala na utrzymanie stabilności dwuwarstwy. Grubość utworzonej dwuwarstwy jest zależna od wykorzystanych lipidów, ale najczęściej nie przekracza kilkudziesięciu nanometrów. Ten parament najczęściej jest wyznaczany w zależności od pojemności elektrycznej błony.

Układ czarnych błon lipidowych pozwala na przeprowadzanie charakterystyki elektrycznej, po uprzednim umieszczeniu elektrod w roztworze. Proste pomiary wskazują, kiedy powstaje oraz kiedy pęka dwuwarstwa lipidowa, ponieważ nienaruszona błona posiada stałą i wysoką rezystancję oraz pojemność elektryczną.

Takie pozwalają również na zbadanie czy białko błonowe wbudowało się w błonę w sposób prawidłowy i czy jest ono aktywne. Aktywne białko błonowe (kanał jonowy) pozwala na przepływ jonów między jedną komorą układu, a druga co można zaobserwować w wyniku wzrostu pojemności elektrycznej. Stopień wzrostu pojemności jest zależny od wielkości białka. Wykorzystując układ BLM możliwa jest również charakterystyka badanego białka – określenie jego aktywatorów oraz inhibitorów. Podanie odpowiedniego związku powoduje odpowiednio otwarcie oraz zamknięcie kanału, co również jest widoczne na BLM.