Sekwencjonowanie DNA: Różnice pomiędzy wersjami

Dodane 252 bajty ,  10 lat temu
poprawki, ilustracja
(ACGT to nukleozydy, a nie nukleozasady, drobne redakcyjne)
(poprawki, ilustracja)
[[Plik:Sanger-DNA-seq.png|thumb|Zasada sekwencjonowania DNA metodą Sangera:<br />'''A.''' – przykładowa sekwencja DNA<br />'''B.''' – przyłączenie startowego [[Oligonukleotydy|oligonukleotydu]] do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA<br />'''C.''' – produkty syntezy DNA, zakończone [[fluorescencja|fluorescencyjnie]] znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)<br />'''D.''' – [[Chromatogram]] rozdziału fragmentów w [[elektroforeza|elektroforezie kapilarnej]].]]
 
'''Sekwencjonowanie DNA''' – technika odczytywania [[sekwencja|sekwencji]], czyli kolejności [[para zasad|par nukleotydowych]] w cząsteczce [[Kwas deoksyrybonukleinowy|DNA]].
 
 
=== Metody historyczne ===
[[Plik:Sanger-DNA-seq.png|thumb|Zasada sekwencjonowania300px|Sekwencjonowania DNA metodą Sangera: z użyciem znakowanych dideoksynukleotydów<br />'''A.''' – przykładowa sekwencja DNA<br />'''B.''' – przyłączenie startowego [[Oligonukleotydy|oligonukleotydu]] do nici matrycowej i kierunek syntezy DNA<br />'''C.''' – produkty syntezy DNA, zakończone [[fluorescencja|fluorescencyjnie]] znakowanymi dideoksynukleotydami (kolorowe litery)<br />'''D.''' – [[Chromatogram]]elektroforegram rozdziału otrzymanej mieszaniny fragmentów w [[elektroforeza#Elektroforeza kapilarna|elektroforezie kapilarnej]]. wraz z zidentyfikowaną sekwencją (powyżej)]]
Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w [[1981]]<ref> {{cytuj książkę |nazwisko=Passarge |imię=Eberhard |autor |tytuł=Genetyka – Ilustrowany przewodnik |wydawca=Wydawnictwa Lekarskie PZWL |miejsce=Warszawa |rok=2004 |strony=52 |isbn=83-200-2908-2}} </ref>- r [[metoda Sangera]], oparta o syntezę DNA przez [[Polimerazy|polimerazę DNA]] ''[[in vitro]]''. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów ([[ddNTP]]), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym [[Nukleotydy|nukleotydem]]. Produkty reakcji rozdziela się [[elektroforeza|elektroforetycznie]], co powoduję ich segregację pod względem wielkości.
[[Plik:Pyrogram1.jpg|thumb|300px|Przykładowy pirogram uzyskany z pirosekwencjonowania]]
Historyczną już i wypieraną metodą jest opracowana w [[19811977]]<ref> {{cytuj książkę |nazwisko=Passarge |imię=Eberhard |autor |tytuł=Genetyka – Ilustrowany przewodnik |wydawca=Wydawnictwa Lekarskie PZWL |miejsce=Warszawa |rok=2004 |strony=52 |isbn=83-200-2908-2}} </ref>- r. [[metoda Sangera]], oparta o syntezę DNA przez [[Polimerazy|polimerazę DNA]] ''[[in vitro]]''<ref name=sanger>{{Cytuj pismo|autor=Sanger, F, Nicklen, S, Coulson, AR|tytuł=DNA sequencing with chain-terminating inhibitors|czasopismo=Proc Natl Acad Sci U S A|rok=1977|oznaczenie=74|wolumin=12|strony=5463–5467|url=http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=431765|id=PMID 431765}}</ref>. Do reakcji dodaje się niewielką ilość trifosforanów dideoksynukleotydów ([[ddNTP]]), które są wbudowywane w DNA, ale ich dołączenie uniemożliwia dalsze wydłużanie nici. W ten sposób otrzymuje się fragmenty DNA o różnej długości zakończone specyficznym [[Nukleotydy|nukleotydem]]. Produkty reakcji rozdziela się [[elektroforeza|elektroforetycznie]], co powoduję ich segregację pod względem wielkości.
 
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli [[Walter Gilbert]] i [[Allan Maxam]] ([[metoda Maxama-Gilberta]])<ref>[http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=265521 A M Maxam and W Gilbert, ''A new method for sequencing DNA'', Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 February; 74(2): 560–564.]</ref>. Gilbert wraz z [[Frederick Sanger|Frederickiem Sangerem]] otrzymali za to osiągnięcie [[Nagroda Nobla|nagrodę Nobla w dziedzinie chemii]]. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.
 
=== Metody współczesne ===
Obecnie metodaodczyt odczytusekwencji zostaław zautomatyzowanametodzie Sangera został zautomatyzowany dzięki wykorzystaniu znakowanych [[fluorescencja|fluorescencyjnie]] trifosforanów dideoksynukleotydów i pozwala na odczyt 300-1000 par zasad z jednej [[kapilara|kapilary]] lub linii na [[żel]]u{{fakt|data=2010-03}}.
 
Autorem alternatywnej metody sekwencjonowania DNA, z wykorzystaniem specyficznej, chemicznej degradacji DNA, byli [[Walter Gilbert]] i [[Allan Maxam]] ([[metoda Maxama-Gilberta]])<ref>[http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?tool=pubmed&pubmedid=265521 A M Maxam and W Gilbert, ''A new method for sequencing DNA'', Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 February; 74(2): 560–564.]</ref>. Gilbert wraz z [[Frederick Sanger|Frederickiem Sangerem]] otrzymali za to osiągnięcie [[Nagroda Nobla|nagrodę Nobla w dziedzinie chemii]]. Metoda Maxama-Gilberta obecnie jest rzadko stosowana.
 
Nowoczesne masowo równoległe aparaty do sekwencjonowania DNA są w stanie pracować z szybkością rzędu milionów [[para zasad|par zasad]] na godzinę{{fakt|data=2010-03}}. [[tranzystor polowy DNA|Tranzystory polowe DNA]] umożliwiają użycie natywnego DNA w hybrydyzacji do [[Mikromacierz DNA|mikromacierzy]] i odczyt w czasie rzeczywistym.
 
=== Metody rozwojowe ===
** 454[[pirosekwencjonowanie]]; sequencingjego wersja "sekwencjonowanie 454" pozwala odczytać 300 MBp na dzień w jednej maszynie [http://en.wikipedia.org/wiki/454_Life_Sciences]. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania [[aDNA]].
* [[Reakcja łańcuchowa polimerazy|PCR]]
* Metodą bąbelkową + pyrosekwencjonowanie
** 454 sequencing pozwala 300 MBp na dzień w jednej maszynie [http://en.wikipedia.org/wiki/454_Life_Sciences]. Metoda ta jest szczególnie przydatna do sekwencjonowania aDNA.
 
* bezpośredniego odczytu{{fakt|data=2010-03}}:
** nanosekwencjonowanie. Przesuwająca się cząsteczka DNA poprzez centrum aktywne modyfikowanych polimeraz jest odczytywana bezpośrednio. Szybkość takiego odczytu może dochodzić od 300 Bp/s dla pojedynczego nanometrowego czujnika<ref>http://visigenbio.com/technology_overview.html</ref>.