ELISA (test immunoenzymatyczny): Różnice pomiędzy wersjami

W podstawowej wersji testu ELISA, pewna ilość [[antygen]]u unieruchomiona jest na powierzchni fazy stałej. Wykonanie testu rozpoczyna się od wprowadzenia materiału biologicznego, najczęściej [[surowicaSurowica (hematologia)|surowicy]] lub [[osocze krwi|osocza]]), w którym badana będzie obecność [[przeciwciałaprzeciwciało|przeciwciał]] specyficznych dla unieruchomionego antygenu. Unieruchomiony antygen i specyficzne dla niego przeciwciała -– o ile są obecne w materiale biologicznym -– tworzą [[kompleks immunologiczny]], dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji, dodawany jest tzw. koniugat czyli przeciwciało skierowane przeciw przeciwciałom ludzkim połączone [[wiązanie kowalencyjne|wiązaniem kowalencyjnym]] z [[Enzymy|enzymem]]. Po ponownym przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu odpowiedniego [[Substrat (chemia)|substratu]], enzym zawarty w koniugacie katalizuje reakcję, której produkt (najczęściej barwny) można ocenić ilościowo metodą [[spektrofotometria|spektrofotometryczną]], służącą do pomiaru intensywności barwy. Poziom intensywności barwy, zależny od stężenia produktu reakcji enzymatycznej, jest proporcjonalny do stężenia przeciwciał w próbce. Równolegle do próbek badanych, przeprowadza się analogiczne etapy reakcji dla tzw. surowic kalibracyjnych (kalibratorów) o znanym stężeniu badanego przeciwciała. Wyniki uzyskane dla kalibratorów pozwalają wykreślić krzywą kalibracyjną, stanowiącą wykres zależności intensywności barwy od stężenia przeciwciał w próbce. Z równania krzywej kalibracyjnej oblicza się stężenie przeciwciał w próbkach badanych. Należy jednak zdawać sobie sprawę z faktu, że przedstawiony powyżej opis działania metody jest silnie uproszczony i może podlegać wielu modyfikacjom, a najważniejsze z nich przedstawiono w dalszej części artykułu.

W tej chwili antygen jest już wyodrębniony z mieszaniny, dzięki użyciu specyficznego przeciwciała, jednak osoba przeprowadzająca badanie nie jest jeszcze w stanie stwierdzić, czy tak się rzeczywiście stało. W tym celu dodawane jest kolejne przeciwciało, tym razem wyznakowane enzymem. Przeciwciało to również jest specyficzne względem poszukiwanego antygenu, jednak rozpoznaje inny region cząsteczki białkowej – dzięki temu przeciwciało użyte do wychwycenia antygenu nie blokuje przeciwciała znakowanego enzymem. Po przepłukaniu uzyskujemy strukturę "kanapki" (sandwicha), antygen rzeczywiście znajduje się pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał. Teraz można dodać już substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem . Zwykle stosuje się związki, które w wyniku reakcji enzymatycznej przechodzą w barwny produkt. Taki test ELISA jest więc także metodą [[Kolorymetria (chemia)|kolorymetryczną]]. Najczęściej stosowane enzymy to fosfataza alkaliczna (substrat: fosforan p-nitrofenolu), peroksydaza chrzanowa(substrat: tetrametylobenzydyna) oraz oksydaza glukozowa (substrat: kwas 5-aminosalicylowy). Stosując [[Spektrofotometria|spektrofotometr]] można więc precyzyjnie określić natężenie barwy po określonym czasie trwania reakcji, dzięki czemu można również określić stężenie antygenu w materiale użytym do badań.