Mario, Peach, Toadsworth wraz z bandąpaczką Toadów lecą na wakacje do Wyspy Delfino (Isle Delfino). Gdy dolatują na miejsce zostają zaatakowani przez dziwną maź z wyglądem czegoś galaretowatego. Tu z pomocą przychodzi FLUDD (Flash Liquidizer Ultra Dousing Device), jeden z wynalazków [[Profesor Elvin Gadd|Profesora Elvina Gadda]]. Mario zostaje oskarżony w sądzie przez mieszkańców wyspy za to, że cała wyspa jest ubrudzona i zostaje aresztowany. Mario i FLUDD muszą zebrać Shine Sprite'y czyli słoneczka które rozświetlą cała wyspę (odpowiednik gwiazdek z [[Super Mario 64]]). Prawdziwym przestępcą podobnym do Maria jest Shadow Mario. Uciekając przed Mariem, otwiera on przejścia do kolejnych etapów. W późniejszej fazie gry okazuje się że Shadow Mario to w rzeczywistości [[Bowser Jr.]], który pracuje dla [[Bowser]]a. Mario nie może opuścić wyspy dopóki jej nie posprząta.
