ELISA (test immunoenzymatyczny): Różnice pomiędzy wersjami

{{źródła}}

 

Zasada działania testu ELISA polega na tym, że przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznawać dane białko (zawarte w materiale biologicznym), które wcześniej zostało unieruchomione na podłożu. Po dodaniu [[przeciwciało|przeciwciał]] następuje utworzenie [[kompleks immunologiczny|kompleksów immunologicznych]], zatem przeciwciało także zostaje unieruchomione. Po wypłukaniu niezwiązanego przeciwciała i dodaniu [[substrat|substratu]] dla enzymu związanego z przeciwciałem zajdzie reakcja enzymatyczna, czemu z kolei będzie towarzyszyło pojawienie się [[produkt reakcji|produkt]]u. Wykrycie jego obecności (może to być np. produkt barwny powstający z bezbarwnego substratu) świadczy o obecności danego białka w badanym materiale. Mierząc z kolei ilość powstającego produktu można także przeprowadzić analizę ilościową. Należy jednak zdawać sobie sprawę z faktu, że przedstawiony właśnie opis działania metody jest silnie uproszczony i może podlegać wielu modyfikacjom, a najważniejsze z nich przedstawiono w dalszej części artykułu.

 

<div style="float: right;padding-left:10px">

 

Pierwszym krokiem jest umieszczenie specyficznego względem danego antygenu przeciwciała na fazie stałej, np. płytce (1, 2). Po wypłukaniu przeciwciał, które nie związały się z płytką, można dodać badany materiał (3). Jak nietrudno zauważyć, jeśli w owym materiale znajduje się poszukiwane białko, będzie się ono łączyć do przeciwciał związanych z płytką. Widać tutaj, jak ważna jest specyficzność przeciwciała, od niej bowiem zależy, czy dany antygen zostanie związany i czy nie nastąpi sfałszowanie testu w wyniku związania innych, podobnych białek.

Jeżeli zatem do wykrycia antygenu używamy swoistego przeciwciała klasy IgG, to drugie przeciwciało musi rozpoznawać właśnie przeciwciała klasy IgG, niezależnie od tego, jaką wykazują one specyficzność. Zaletą tej metody jest to, że nie trzeba znakować specyficznych względem antygenu przeciwciał. Pozwala to na użycie różnych przeciwciał pierwszorzędowych, bez potrzeby dodatkowych manipulacji związanych z ich znakowaniem, po czym przeciwciała te mogą zostać wykryte za pomocą zawsze takich samych przeciwciał znakowanych. Poniższy rysunek pokazuje różnice między bezpośrednim (1) i pośrednim (2) testem ELISA (jest to już wynik końcowy, bez ukazywania kolejnych kroków):

 

 

=== Wykrywanie swoistych przeciwciał testem ELISA ===

 

<div style="float: left;padding-right:10px">

W celu wykrycia przeciwciał należy opłaszczyć fazę stałą antygenem (1), przeciwko któremu skierowane są poszukiwane przeciwciała. W przypadku zastosowań diagnostycznych dostępne są zwykle gotowe, opłaszczone antygenem płytki. Na tak przygotowane podłoże nanosi się [[Surowica (hematologia)|surowicę]] pacjenta i po odpowiednim czasie inkubacji płytkę się przepłukuje. Jeżeli przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi znajdowały się w surowicy, zwiążą się one z antygenem na płytce (2). Za pomocą drugiego przeciwciała lub innego wyznakowanego ligandu można nie tylko wykryć przeciwciała, ale nawet określić ich klasę (4, 5), co może dostarczyć dodatkowych informacji o chorobie lub danych epidemiologicznych (np. obecność tylko przeciwciał [[IgM]] świadczy o tym, że chory przechodzi pierwsze w życiu zakażenie danym drobnoustrojem, zaś obecność IgG świadczy o kolejnym zakażeniu).