Mikroskop dwufotonowy: Różnice pomiędzy wersjami

Mikroskopia dwufotonowa wykorzystuje pomysł opisany przez [[Maria Göppert-Mayer|Marię Göppert-Mayer]] w jej pracy [[doktor]]skiej w [[1931]]. Idea tej techniki opiera się na fakcie, że dwa [[foton]]y o mniejszej energii, spotykające się w tym samym czasie w pobliżu [[fluorofor]]a mogą go wzbudzić i wywołać jego [[fluorescencja|fluoroscencję]]. Każdy z tych fotonów padający osobno na fluorofor, nie wywołałby emisji, z powodu zbyt niskiej energii wzbudzenia. Jakkolwiek [[prawdopodobieństwo]] jednoczesnego [[absorpcja (fizyka)|zaabsorbowania]] dwóch fotonów jest niezywkleniezwykle niskie, stąd by wzbudzić fluorofor, potrzebny jest ich gęsty strumień. W praktyce mikroskopie dwufotonową zastosował Winfried Denk w [[Cornell University]]. Dodatkowo połączył on pomysł dwufotonowości ze [[Skaner (czytnik)|skaner]]em [[laser]]owym.

Najczęściej używane [[fluorofor]]y mają widma wzbudzenia w zakresie 400-500 [[nano|n]][[metr|m]], gdy laser w mikroskopii dwufotonwej ma zakres 700-1000nm (podczerwień). Jeśli fluorofor zaabsorbuje jednocześnie dwa takie fotony o obniżonej energii, dostanie jej wystarczająco, by zostać wzbudzonym do wyższego [[Stan wzbudzony|stanu energetycznego]]. Wracając do [[Stan stacjonarny|stanu podstawowego]] wyemituje już pojedyńczypojedynczy foton, o odpowiedniej energii, zależnie od typu fluoroforu (zwykle w [[Światło widzialne|zakresie widzialnym]]).

Jak wspomniano, prawdopodobieństwo wzbudzenia fluoroforu przez dwa różne fotony jest niskie i zależne od kwadratu natężenia wiązki wzbudzającej. Jednak zapewnia to, że wzbudzenie nastąpi tylko w punkcie ogniskowania wiązek. Za pomocą zwierciadła skanującego można przesuwać punkt ogniskowania po płaszczyźnie ogniskowania i w ten sposób skanować daną płaszczyznę próbki. Przesuwając punkt ogniskowania w góregórę i w dół możemy także skanować trzeci wymiar. Dużą zaletą systemu dwufotonowego jest to, że używane do wzbudzania [[światło]] podczerwone, nie ulega rozpraszaniu tak silnie jak krótsze fale (co podnosi [[rozdzielczość]] obrazowania, ponadto ma ono lepszą zdolność do penetracji próbki (z drugiej strony fala dłuższe niż 1400nm są z kolei bardzo silnie pochłaniane przez [[woda|wodę]] obecną w preparatach). Dłuższa [[fala]] niesie także mniej [[energia|energii]], co obniża możliwe uszkodzenia powodowane przez światło poza płaszczyzną ogniskowania, przy przechodzeniu przez próbkę (fototoksyczność). Wadami systemu jest ich wysoka cena, na która wpływa konieczność stosowania drogiego laserulasera podczerwonego i dostosowanej do niego optyki. Także [[Widmo (spektroskopia)|widma]] absorpcji fluoroforów w systemie dwufotonowym różnią się od tych w systemie jednofotonowym, co często pociąga za sobą konieczność stosowania niestandartowychniestandardowych rozwiązań w tej kwestii.