CLARITY
CLARITY (ang. Clear, Lipid-exchanged, Acrylamide-hybridized Rigid, Imaging/immunostaining compatible, Tissue hYdrogel) – metoda służąca do otrzymywania preparatów biologicznych w postaci przezroczystych mózgów, po ich wcześniejszej izolacji.
Technika edytuj
Wyizolowany mózg zostaje umieszczony w mieszaninie, której główne składniki stanowią monomery (np. akrylamidu) oraz aldehyd mrówkowy. Podczas inkubacji przeprowadzanej w temperaturze 4 °C monomery wraz z aldehydem mrówkowym przenikają w głąb tkanki. Następuje wiązanie monomerów do białek, kwasów nukleinowych oraz małych cząsteczek, takich jak neurotransmitery. W kolejnym etapie podgrzanie próbki do temperatury 37 °C wywołuje polimeryzację monomerów, a w konsekwencji stworzenie swoistej, akrylamidowej siatki. Siatka ta wiąże cząsteczki obdarzone konkretnymi grupami funkcyjnymi, których pozbawione są lipidy błon komórkowych. Dzięki temu przeprowadzenie elektroforezy na tym etapie umożliwia „wymycie” z mózgu lipidów błonowych, pozostawiając jedynie siatkę akrylamidową ze związanymi białkami i kwasami nukleinowymi[1].
Zastosowanie edytuj
Mózg otrzymany tą metodą pozostaje cały, nietknięty, z biomolekułami znajdującymi się na ich pierwotnym miejscu. Lipidy naturalnie obecne w tkance stanowią znaczną barierę dla światła oraz cząsteczek używanych podczas badań, np. przeciwciał. W mózgach CLARITY brak lipidów pozwala na znacznie efektywniejsze wykorzystanie technik m.in. mikroskopii oraz immunocytochemii. Dzięki temu można zobaczyć więcej oraz dotrzeć głębiej w tkankę. Ponadto możliwe jest badanie mózgu jako nienaruszonej całości, a w konsekwencji lepsze zbadanie połączeń występujących pomiędzy różnymi obszarami mózgu[2].
Ograniczenia edytuj
Publikacja metody CLARITY miała miejsce w połowie 2013 roku. Na tym etapie trudno wskazywać na jej ograniczenia, a raczej chwilowe niedoskonałości, które w toku prac mogą zostać wyeliminowane. Podczas preparowania metodą CLARITY utracie podlega 8% wszystkich białek (w porównaniu do np. 24% przy użyciu innych, powszechnie stosowanych metod); trwają badania nad zmniejszeniem tej wartości. Oprócz tego pozostają problemy techniczne, takie jak opracowanie algorytmów przetwarzających ogromne ilości danych w postaci zdjęć mikroskopowych w mniejsze i użyteczne informacje[3]. Metodą CLARITY konserwuje się głównie mózgi mysie; w roku 2014 nie było możliwości spreparowania mózgu ludzkiego ze względu na jego wielkość.
Przypisy edytuj
- ↑ Kwanghun Chung, Jenelle Wallace, Sung-Yon Kim, Sandhiya Kalyanasundaram, Aaron S. Andalman, Thomas J. Davidsos, Julie J. Mirzabekov, Kelly A. Zalocusky, Joanna Mattis, Aleksandra K. Denisin, Sally Pak,Hannah Bernstein, Charu Ramakrishnan, Logan Grosenick,Viviana Gradinaru, Karl Deisseroth. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. „Nature”. 497 (7449), s. 332-337, marzec 2013. DOI: 10.1038/nature12107.
- ↑ Sung-Yon Kim, Kwanghun Chung, Karl Deisseroth. Light microscopy mapping of connections in the intact brain. „Trends in Cognitive Sciences”. 1258, s. 1-4, 2013. DOI: 10.1016/j.tics.2013.10.005.
- ↑ Kwanghun Chung, Karl Deisseroth. CLARITY for mapping the nervous system. „Nature Methods”. 10 (6), s. 508-513, czerwiec 2013.